差示掃描量熱法如何測量生物分子穩(wěn)定性

發(fā)布日期：2023-10-08      瀏覽次數(shù)：630

                                                               差示掃描量熱法如何測量生物分子穩(wěn)定性

差示掃描量熱法(主要用于表征生物分子（如蛋白質(zhì)）的穩(wěn)定性。重要的是，它是對其天然形式的生物分子的直接測量。差示掃描量熱法測量可以提供關(guān)于熱穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)，并作為結(jié)構(gòu)指紋來評估構(gòu)象。通過以恒定速率加熱分子，測量與生物分子熱變性相關(guān)的熱量變化。差示掃描量熱法的優(yōu)點;由于差示掃描量熱法依賴于熱測量，因此可以表征天然生物分子，而不必具有光學(xué)透明的樣品。通過差示掃描量熱法測量的特性提供了熔化溫度，但也提供了生物分子內(nèi)折疊和展開力的數(shù)據(jù)。

差示掃描量熱法的用途
差示掃描量熱法經(jīng)常用于藥物開發(fā)?？梢允褂脽崃坑嫷囊恍╆P(guān)鍵領(lǐng)域包括：生物治療開發(fā)中穩(wěn)定蛋白質(zhì)和潛在候選物的選擇和表征;配體的相互作用研究;制造和純化條件的優(yōu)化;確定液體制劑的條件;了解基本平衡熱力學(xué)，要了解差示掃描量熱法的工作原理及其可為準(zhǔn)確生物分子測量提供的好處，了解基本平衡熱力學(xué)非常重要。本質(zhì)上，蛋白質(zhì)和其他生物分子可以在N和D構(gòu)象之間轉(zhuǎn)移：N–結(jié)構(gòu)化、天然和生物活性構(gòu)象;D–非結(jié)構(gòu)化、變性和無活性的構(gòu)象;這種轉(zhuǎn)移是通過溫度升高超過特定范圍而發(fā)生的。該過程不僅限于蛋白質(zhì)。其他受影響的生物分子包括：有機聚合物;生物大分子，如DNA和脂質(zhì);差示掃描量熱法中使用的儀器;用于差示掃描量熱法測量的關(guān)鍵儀器是熱量計。較新的型號，如差示掃描量熱法，在采樣和分析方面提供了許多自動化優(yōu)勢。樣品加載后儀器的無人值守操作可以節(jié)省操作員的時間，提高工作效率。自動化數(shù)據(jù)分析可以更快地生成高度可重復(fù)的熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)并符合法規(guī)要求。差示掃描量熱法儀器使用和協(xié)議;正確的使用方法和協(xié)議對于確保正確準(zhǔn)備儀器和樣品以及安全執(zhí)行實驗至關(guān)重要。這些協(xié)議也記錄在美國醫(yī)學(xué)圖書館中。

啟動儀器
通用指南可能因儀器而異。如有疑問，請務(wù)必查看儀器手冊或聯(lián)系制造商。打開熱量計并增加細(xì)胞壓力。這可以抑制樣品沸騰和防止氣泡。在大多數(shù)熱量計中，使用氮氣。根據(jù)制造商的指南調(diào)整氮氣壓力。這應(yīng)該與電池的構(gòu)成材料一致。將清潔劑儲存器加注到正確的體積。保溫室溫度應(yīng)設(shè)置為正確的值，以在開始實驗前保持樣品完整性。準(zhǔn)備樣品;針對作為實驗參考的緩沖液透析您的樣品。作為替代方案，可以使用在蛋白質(zhì)純化的一步收集的洗脫緩沖液。使用凱氏定氮法或洛瑞法確定樣品的濃度。使用合適的方法。在單個研究中繼續(xù)使用相同的方法來保持客觀的結(jié)果比較。在真空中對樣品和緩沖液進(jìn)行脫氣。此處的目的是去除可能導(dǎo)致體積不準(zhǔn)確的微氣泡。在一些較新的熱量計中，這可以跳過。此步驟需要在層流生物安全柜中使用微量移液器和無菌吸頭。成對地將樣品及其緩沖液裝入與熱量計兼容的96孔板中。僅用緩沖液填充前兩對孔，僅用水填充后兩對孔。緩沖液掃描將有助于驗證儀器并建立基線。水掃描將清潔細(xì)胞。從生物防護(hù)柜中取出孔板之前，確保用密封膜正確密封孔板。這有助于防止污染。將板放入儀器的樣品保存室時，確保板的方向正確。

實驗設(shè)置參數(shù)
在軟件中輸入樣品信息。如果可用，也輸入濃度。如果沒有，請在數(shù)據(jù)分析前將濃度值輸入分析軟件。設(shè)置清潔選項;根據(jù)樣品設(shè)置實驗的起始溫度。如果樣品未知，請從低溫開始。設(shè)置實驗溫度。這取決于樣本。選擇實驗的掃描速率。這也取決于個別實驗，但通常為60°C/h、90°C/h或120°C/h。如果您正在掃描未知樣品，建議以不同的速率掃描并檢查樣品內(nèi)展開的動力學(xué)。為了確定熱解折疊的可逆性，您應(yīng)該重新掃描樣品。如果第二次掃描的焓至少是第一次掃描的焓值的80%，則展開被認(rèn)為是可逆的。為了保存熱量計中的細(xì)胞，實驗后將恒溫器設(shè)置為10°C;在開始實驗之前，仔細(xì)檢查所有參數(shù)并確保它們符合實驗范圍所需的準(zhǔn)則。